Cara Pembuatan Preparat Sederhana dan Menurut Gram

Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana dan pengecatan gram atau pengecatan bertingkat, tetapi beberapa genus anggota dari genus mycobacterium bersifat resisten dan hanya dapat dilihat dengan metoda tahan asam.

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh larena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Pewarnaan sederhana, sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas objek gelas yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspense bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspense bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop.

 Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan meletakkan sel bakteri pada objek gelas tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005).

Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transaparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bisa yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair.kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).

Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi bakteri, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membrane sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negative. Bakteri gram positif mempunyai dinding sel tebal dan membrane sel selapis. Sedangkan bakteri gram negative mempunyai dinding sel tipis yang berada diantara dua lapisan membrane sel. Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan ini juga disebut pewarnaan diferensial atau pewarnaan bertingkat. Prinsipnya bakteri dengan pewarnaan utama yaitu dengan Kristal violet akan berwarna ungu, melalui fiksasi warna dengan lugol akan menguatkan pelekatan warna utama, penambahan alcohol akan melunturkan atau memucatkan zat warna utama sehingga pada sel gram negative sel menjadi tidak berwarna tetapi pada sel gram positif tidak mengalami pelunturan sehingga tetap berwarna ungu. Pada pemberian pewarnaan tandingan yang berbeda dengan pewarna utama yaitu fucin basa menebabkan bakteri gram negative akan menyerap warna tersebut menjadi merah.

Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku yakni sebagai berikut: mempersiapkan kaca objek. Kaca objek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat lapisan dari bakteri yang diwarnai. Mempersiapkan preparat , preparat yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis. Preparat ini dapat berasal dari biakan cair atau padat. Biakan cair suspense sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca objek lalu preparat pada kaca objek lebar dan biakan mongering dengan cara fiksasi.

Biakan padat bakteri yang kulturnya pada media padat tidak dapat langsung dibuat preparat seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dahulu, dengan cara meletakkan setetes air pada kaca objek lalu dengan jarum inokulasi diambil bakteri dari biakan padat, biarkan mongering atau dilakukan dengan cara fiksasi.

Alat dan Bahan
    Alat dan bahan yang kita butuhkan dalam pembuatan preparat ini diantaranya :

       1.      Kaca objek

       2.      Biakan dari e.coli pada agar kaldu miring

       3.      Jarum inokulasi

       4.      Gelas kimia berisi air dengan sebatang pengaduk kaca

       5.      Lampu Bunsen

       6.      Kertas saring

       7.      Mikroskop

       8.      Kapas

       9.      Larutan lugol

   10.      Alcohol 90%

   11.      Gelas kimia 100 mL

   12.      Stopwatch

   13.      Fuchin basa

Praktikum

a.    Pembuatan preparat sederhana

                1.      Mensterilkan kaca preparat dengan alcohol 90%

                2.      Mengambil akuades dengan pipet tetes

                3.      Meletakkan diatas preparat

                4.      Mengambil biakan bakteri menggunakan jarum ose, lakukan secara steril

                5.      Meletakkan biakan ke dalam preparat hingga rata

                6.      Melakukan fiksasi terhadap preparat

                7.      Meneteskan Kristal violet dan fucin basa ke atas preparat

                8.      Menunggu hingga 1 menit

                9.      Membilas dengan akuades

            10.      Mengamati dengan mikroskop.

b.   Pembuatan preparat berwarna menurut gram

                1.      Melakukan hal ang sama (1-6) pada pembuatan preparat sederhana

                2.      Meneteskan gram A (Kristal violet) ke atas preparat tunggu hingga 1 menit

                3.      Membilas dengan akuades

                4.      Meneteskan gram B (larutan lugol) ke atas preparat tunggu hingga ¾ menit

                5.      Membilas dengan akuades

                6.      Meneteskan gram C (alcohol) ke atas preparat tunggu hingga 1 menit

                7.      Membilas dengan akuades

                8.      Meneteskan gram D (fucin basa) ke atas preparat, tunggu hingga 3 menit

                9.      Membilas dengan akuades

              10.      Mengamati di mikroskop.

Analisis dan Pembahasan

           Pada praktikum ini kita membuat preparat bakteri, sebelum membuat preparat bakteri usahakan semua alat dan media yang digunakan tersebut sudah steril. Sebelum memindahkan bakteri ke kaca objek kita harus memijarkan dulu jarum ose dan tabubg reaksi bakteri, setelah itu ambil sedikit saj bakteri dari biakan induk bakteri lalu gesekkan pada kaca objek secara hati-hati. Kalu bakteri terlalu tebal tetesi dengan air, dan sebarkan secara merata.

Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis agar bakteri dengan mudah dapat diidentifikasi. Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada berbagai macam tergantung pada specimen dan penelitian yang dibutuhkan, antara lain fiksasi yaitu suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistic dengan menggunakan Kristal violet.

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas bentuk dan ukuran bakteri seperti dinding sel dan vakuol, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia ang khas dari pada bakteri dengan zat warna serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

Ada beberapa factor yang memepngaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histology yaitu Cristian Gram (Capucino dan Shesman, 1983).

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan atu jenis zat warna untuk mewarnai organism tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitiplasmanya bersifat basofilik (suka air dan basa). Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan dalam memberikan zat warna memiliki muatan negative. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negative banyak ditemukan pada permukaan sel. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersidat alkalin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana adalah Kristal violet dan fucin basa.

Pada pewarnaan sederhana menggunakan satu macam pewarnakristal violet untuk objek gelas yang pertama dan fucin basa untuk objek gelas yang kedua, sehingga ketika diamati dengam menggunakan mikroskop maka pada bakteri e.coli akan terlihat berwarna biru keungu-unguan untuk objek gelas yang pertama dengan Kristal violet, pada objek gelas kedua yaitu dengan fucin basa e.coli terlihat berwarna ungu merah.

Pewarnaan gram atau bertingkat menghasilkan dua kelompok besar bakteri, yaitu gram positif yang berwarna ungu dan gram negative yang berwarna merah. Adanya gram positif dan gram negative disebabkan oleh perbedaan pandangan dinding sel bakteri. Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal dibandingkan pada dinding gram negative. Zat warna yang digunakan pada pengecetan gram meliputi Kristal violet, lugol, alcohol, dan fucin basa. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah:

       1.      Kristal violet

Berwarna ungu dan merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberikan warna mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna ungu.

       2.      Lugol

Merupakan pewarna mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemeberian lugol pada pengecatan gram ini dimaksudkan untuk memperkuat pengikat warna oleh bakteri.

       3.      Alcohol

Merupakan solven organic yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri. Pemberian alcohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan:

• Mikroorganisme tetap berwarna ungu kebiruan
• Bakteri mejadi tidak berwarna

       4.      Fucin basa

Merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alcohol. Dengan kata lain memberikan warna pada mikroorganisme non target.

Pada pewarnaan gram ini ditemukan bahwa bakteri e.coli setelah diamati dengan menggunakan mikroskop terlihat berwarna ungu kebiruan. Menurut praktikum bakteri e.coli merupakan bakteri gram positif karena dapat mempertahankan warna ungunya. Tetapi menurut referensi e.coli merupakan bakteri gram negative yang tidak mempertahankan warna ungunya sehingga berubah warna menjadi merah.

Kesimpulan

              Dari hasil pengamatan yang sudah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa preparat dari kultur cair. Preparat dibuat dari kultur e.coli. Teknik pewarnaan untuk identifikasi e.coli dilkukan dengan 2 cara yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram/bertingkat. Berdasarkan teknik pewarnaan tersebut dapat disimpulkan bahwa e.coli merupakan gram negative menurut referensi tetapi menurut praktikum merupakan gram negative.

sumber

Penemuan antiseptik

Secara umum septis berati efek toksis dari mikroorganisma penyebab
penyakit pada tubuh selama infeksi. Antiseptik; ukuran-ukuran yang menghentikan
efek tersebut dengan pencegahan infeksi.
 Oliver Weldell Holmes (1809 – 1894) seorang dokter Ameraka pada tahun
1843 menekankan bahwa penyakit demam pada wanita bersifat menular. Oleh
karena itu ditularkan dari satu wanita lain melalui tangan dikter.

Tahun 1846 seorang dokter dari Hungaria, Ignaz Philipp Semmelweiz
menemukan penggunaan klorin sebagai desinfektan bagi tangan dokter. Pada tahun
1860 ahli bedah dari Inggris, Josept Lister menemukan asam karbol atau phenol
dapat digunakan untuk membunuh bakteri. Lister menggunakan larutan ini untuk
merendam alat-alat bedah dan menyemprot ruangan operasi. Cara tersebut
demikian sukses untuk mengatasi infeksi setelah operasi yang sebelumnya
menyebabkan kematian 45% dari pasiennya. Cara tersebut segera dapat diterima
dan dilakukan oleh ahli bedah yang lain. Penemuan tersebut merupakan hari
penemuan teknik aseptik untuk mencegah infeksi. Sekarang ini berbagai macam
senyawa kimia dan alat fisik lain dapt mengurangi mikroorganisma di ruang operasi,
ruangan untuk bayi prematur dan ruangan tempat memasukkan obat ke dalam kontainer yang steril.

CHEMOTERAPI

Chemoterapi telah dilakukan selama ratusan tahun. Misalnya; merkuri telah digunakan untuk mengobati syilis pada tahun 1495 dan kulit kayu pohon kina (cinchona) digunakan untuk mengobati malaria. Orang tahu bahwa tumbuhan berperan sebagai sumber bahan untuk chemoterapi.

Paul Erlich meulai chemoterapi modern dengan membuat ‘magig bullet’ senyawa kimia yang dapat membunuh mikroba spesifik penyebab sifilis tanpa membahayakan orangnya. Ia menyebut camouran tadai dengan ‘salvarsan’ yang terbukti sangat efektif membasmi bakteri penyebab sifilis. Untuk penemuan tersebut Ia mendapat Nobel tahun 1908. Alexander Fleming (1881 – 1955) menemukan
penicilin, senyawa kimia yang dihasilkan mikroorganisma jamur Peniceliium notatum. Fleming menduga bahwa jamur tersebut menghasilkan sesuatu yang menghambat pertumbuhan bakteri. Tulisannya mengenai hal tersebut tidak mendapat perhatian sampai 10 tahun kemudian saat peneliti dari Universitas Oxford mencoba menemukan senyawa antibakteri yang berasal dari mikroorganisma. Sebagian dari riset ini untuk mengobati korban perang dunia kedua dan penyakit ternak. Peneliti yang dipimpin oleh Howard W.Florey dan Ernst Chain melakukan pengobatan
dengan penicilin yang hasilnya sangat memuaskan. Penicilin selanjutnya dianggap
sebagai ‘miracle drug’. Dan bertiga, Florey, Chain dan Fleming mendapat Nobel
untuk penemuan tersebut

IMUNISASI

Tahun 1880, Pasteur menggunakan teknik dari Konch untuk mengisolasi dan membiakkan bakteri yang menyebabkan kolera pada ayam. Untuk membuktikan penemuannya, Pasteur membuat demonstrasi dihadapan publik tentang percobaannya yang telah dilakukan berulang kali di laboratorium. Dia menginjeksikan biakkan bakteri kolera pada ayam sehat dan menunggunya sampai
ayam tersebut menunjukkan gejala penyakit. Akan tetapi hasilnya membuat Pasteur mendapat malu karena ayamnya tetap hidup dan sehat. Pasteur kemudian mengevaluasi langkah-langkah yang menyebabkan demonstrasi tersebut gagal. Dia menemukan bahwa secara kebetulan dia menggunakan biakan tua seperti yang telah dilakukan sebelumnya, dan satu kelompok adalah ayam yang tidak pernah di inokulasi. Selanjutnya kedua kelompok ayam tersebut diinjeksi dengan biakan segar.
Hasilnya, kelompok ayam yang kedua mati sedang kelompok ayam yang pertama tetap sehat.

Pertama hal ini membuatnya bingung, tetapi Pasteur segera menemukan jawabannya. Pasteur menemukan bahwa, bakteri jika dibiarkan tumbuh menjadi biakan tua menjadi avirulen yaitu kehilangan virulensinya atau kemampuan untuk menyebabkan penyakit. Tetapi bakteri avirulen ini masih dapat menstimulasikan sesuatu dalam tubuh host dan pada infeksi berikutnya manjadi imun atau tahan terhadap penyakit. Pasteur selanjutnya menerapkan prinsip imunisasi untuk mencegah anthrax. Pasteur menyebut bakteri yang telah avirulen tersebut engan vaccin dari bahasa latin vaccayang artinya sapi dan imunisasi dengan biakan tersebut dikenal dengan vaksinasi.

Dengan vaksinasi tersebut Pasteur mengenali atau mengetahui hasil kerja
sebelumnya yang dilakukan oleh Edward Jenner (1749 – 1823) yang telah sukses
memfaksinasikan para pekerjanya di peternakan yang telah terkena copox dari
ternak sapinya tetapi tidak pernah berkembang menjadi serius. Jenner menduga
bahwa karena terbiasa menghadapi cowpox akan mencegahnya dari serangan
smallpox. Untuk membuktikan hipotesisnya ini Jener menginokulasi James Phipps
pertama dengan materi yang menyebabkan cowpox yang diambil dari luka,
kemudian dengan agen smallpox. Anak laki-laki tersebut tidak menunjukkan gejala
smallpox. Nama Pasteur selanjutnya dikenal dimana-mana dan oleh banyak orang
dianggap sebagai peneliti tentang mikroorganisma yang ajaib. Untuk itu ia diminta
membuat vaccin pencegah hidrofobia atau rabies, penyakit yang ditularkan ke
manusia melalui gigitan anjing, kucing, atau binatang yang terinfeksi lainnya.
Pasteur adalah seorang ahli kimia, bukan dokter dan Pasteur tidak biasa
memperlakukan manusia. Disamping kenyataan bahwa penyebab penyakit rabies
adalah belum diketahui, tetapi Pasteur mempunyai keyakinan yang kuat bahwa itu
adalah mikroorganisma. Ia dapat membuat kelinci terkena penyakit setelah diinokulasi dengan saliva anjing.

Selanjutnya Pasteur dan asistennya mengambil otak dan tulang belakang kelinci tersebut dan mengeingkannya dan membuatnya menjadi larutan. Anjing yang diinokulasi dengan campuran tersebut dapat terhindar dari rabies. Akan tetapi vaksinasi terhadap anjing sangat berbeda dengan manusia.
Pada bulan Juli 1885, seorang anak laki-laki bernama Joseph Meister digigit oleh
serigala dan keluarganya membujuk Pasteur untuk menginokulasi anak tersebut.
Kekawatiran Pasteur dan orang-orang menjadi berkurang setelah anak laki-laki
tersebut tidak mati. Selanjutnya Pasteur menjadi terkenal dan memperoleh banyak
dana yang kemudian digunakan untuk mendirikan Institute Pasteur di Paris yang
sangat terkenal.

Perkembangan dan Pencegahan penyakit

Epidemik adalah penyakit tertentu yang menyerang banyak daerah misalnya
penyakit bubon yang dikenal dengan penyakit hitam yang mematikan yang
disebabkan oleh bakteri terjadi di Eropa selama perioda 1347 – 1350. Sepertiga
sampai setengah populasi di Eropa meninggal karena penyakit tersebut.
Hewan pengerat, terutama tikus, berperan sebagai sumber bakteri bacillus dan
ditransmisikan/ditularkan ke manusia melalui lalat. Slama 1917 – 1919 malaria telah
membunuh setengah juta penduduk Amerika dan 21 manusia di seluruh dunia.
Jumlah tersebut mencapai 3 kali jumlah manusia yang terbunuh selama perang
dunia I. Jadi mikroba terbukti lebih mematikan dibanding peluru.
 Dengan pengetahuan bahwa mikroorganisma dapat merupakan penyebab
penyakit ilmuwan lebih memusatkan perhatiannya pada cara pencegahan dan perlakuannya.

POSTULAT KOCH

Pada tahun 1880, Koch memanfaatkan kemajuan metoda laboratorium dan
menentukan kriteria yang diperlukan untuk membuktikan bahwa mikroba spesifik  merupakan penyebab penyakit tertentu. Kriteria ini dikenal dengan postulat Koch yaitu:

1. Mikroorganisma tertentu selalu ditemukan berasosiasi dengan penyakit yang
ditimbulkan.
2. Mikroorganisma dapat diisolasi dan ditumbuhkan sebagai biakan murni di
laboratorium.
3. Biakan murni tersebut bila diinjeksikan pada binatang yang sesuai dapat
menimbulkan penyakit.
4. Mikroorganisma tersebut dapat diisolasi kembali dari hewan yang telah
terinfeksi tersebut.

Adanya kriteria tersebut menjadi jalan ditemukannya berbagai bakteri
penyebab berbagai penyakit dalam waktu yang cukup singkat (kurang dari 30 tahun). Penemuan virus, adanya bakteri yang dapat menimbulkan berbagai penyakit serta adanya penyakit tertentu yang ditimbulkan oleh lebih dari 1 mikroorganisma
memerlukan modifikasi dari postulat Koch.

Pada tahun 1892 Dimitri Ivanovski menunjukkan bahwa agen yang
menyebabkan penyakit mosaik pada tembakau dapat ditularkan melalui ekstrak
tanaman yang sakit. Ekstrak terebut disaring dengan filter yang ditemukan oleh
kawan-kawan Pasteur dimana filter tersebut diketahui dapat menyaring bakteri.
Penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa agen tersebut mempunyai ukuran yang
jauh lebih kecil dari bakteri. Yellow fever merupakan penyakit pertama pada manusia
yang diketahui disebabkan oleh virus.

Pada tahun 1900 seorang ahli bedah bernama Walter reed (1851-1902)
dengan menggunakan manusia sebagai volunteer membuktikan bahwa virus
tersebut dibawa oleh nyamuk tertentu lainnya membawa protozoa penyebab
malaria. Salah satu cara penting untuk mencegah penyakit tersebut adalah
mengurus air yang tergenang yang digunakan nyamuk untuk tempat berkembang
biak.