Tahun 1880, Pasteur menggunakan teknik dari Konch untuk mengisolasi dan membiakkan bakteri yang menyebabkan kolera pada ayam. Untuk membuktikan penemuannya, Pasteur membuat demonstrasi dihadapan publik tentang percobaannya yang telah dilakukan berulang kali di laboratorium. Dia menginjeksikan biakkan bakteri kolera pada ayam sehat dan menunggunya sampai
ayam tersebut menunjukkan gejala penyakit. Akan tetapi hasilnya membuat Pasteur mendapat malu karena ayamnya tetap hidup dan sehat. Pasteur kemudian mengevaluasi langkah-langkah yang menyebabkan demonstrasi tersebut gagal. Dia menemukan bahwa secara kebetulan dia menggunakan biakan tua seperti yang telah dilakukan sebelumnya, dan satu kelompok adalah ayam yang tidak pernah di inokulasi. Selanjutnya kedua kelompok ayam tersebut diinjeksi dengan biakan segar.
Hasilnya, kelompok ayam yang kedua mati sedang kelompok ayam yang pertama tetap sehat.
Pertama hal ini membuatnya bingung, tetapi Pasteur segera menemukan jawabannya. Pasteur menemukan bahwa, bakteri jika dibiarkan tumbuh menjadi biakan tua menjadi avirulen yaitu kehilangan virulensinya atau kemampuan untuk menyebabkan penyakit. Tetapi bakteri avirulen ini masih dapat menstimulasikan sesuatu dalam tubuh host dan pada infeksi berikutnya manjadi imun atau tahan terhadap penyakit. Pasteur selanjutnya menerapkan prinsip imunisasi untuk mencegah anthrax. Pasteur menyebut bakteri yang telah avirulen tersebut engan vaccin dari bahasa latin vaccayang artinya sapi dan imunisasi dengan biakan tersebut dikenal dengan vaksinasi.
Dengan vaksinasi tersebut Pasteur mengenali atau mengetahui hasil kerja
sebelumnya yang dilakukan oleh Edward Jenner (1749 – 1823) yang telah sukses
memfaksinasikan para pekerjanya di peternakan yang telah terkena copox dari
ternak sapinya tetapi tidak pernah berkembang menjadi serius. Jenner menduga
bahwa karena terbiasa menghadapi cowpox akan mencegahnya dari serangan
smallpox. Untuk membuktikan hipotesisnya ini Jener menginokulasi James Phipps
pertama dengan materi yang menyebabkan cowpox yang diambil dari luka,
kemudian dengan agen smallpox. Anak laki-laki tersebut tidak menunjukkan gejala
smallpox. Nama Pasteur selanjutnya dikenal dimana-mana dan oleh banyak orang
dianggap sebagai peneliti tentang mikroorganisma yang ajaib. Untuk itu ia diminta
membuat vaccin pencegah hidrofobia atau rabies, penyakit yang ditularkan ke
manusia melalui gigitan anjing, kucing, atau binatang yang terinfeksi lainnya.
Pasteur adalah seorang ahli kimia, bukan dokter dan Pasteur tidak biasa
memperlakukan manusia. Disamping kenyataan bahwa penyebab penyakit rabies
adalah belum diketahui, tetapi Pasteur mempunyai keyakinan yang kuat bahwa itu
adalah mikroorganisma. Ia dapat membuat kelinci terkena penyakit setelah diinokulasi dengan saliva anjing.
Selanjutnya Pasteur dan asistennya mengambil otak dan tulang belakang kelinci tersebut dan mengeingkannya dan membuatnya menjadi larutan. Anjing yang diinokulasi dengan campuran tersebut dapat terhindar dari rabies. Akan tetapi vaksinasi terhadap anjing sangat berbeda dengan manusia.
Pada bulan Juli 1885, seorang anak laki-laki bernama Joseph Meister digigit oleh
serigala dan keluarganya membujuk Pasteur untuk menginokulasi anak tersebut.
Kekawatiran Pasteur dan orang-orang menjadi berkurang setelah anak laki-laki
tersebut tidak mati. Selanjutnya Pasteur menjadi terkenal dan memperoleh banyak
dana yang kemudian digunakan untuk mendirikan Institute Pasteur di Paris yang
sangat terkenal.